Люси Стиллман, сотрудник Абстерго и член братства современных ассасинов, освобождает Дезмонда и прячет его в секретном укрытии к двум другим ассасинам, Шону Хастингсу и Ребекке Крэйн. С их аналогом «Анимус 2.0», они приглашают Дезмонда помочь им использовать его генетическую память о его предке, Эцио Аудиторе да Фиренце, по двум причинам: тренировать Дезмонда навыкам ассасина с помощью эффекта просачивания, и найти другие Частицы Эдема.

Действие сиквела разворачивается в Италии, во время Эпохи Возрождения (конец XV века). Главным героем в анимусе становится 17-тилетний юноша по имени Эцио. Его отца, Джованни Аудиторе, предал лучший друг. И в ходе обвинения, отец с братьями были повешены. Потеря семьи для Эцио была душевной травмой. Он убивает предателя его отца и пытается укрыться вместе с матерью и сестрой у своего дяди Марио, на вилле Аудиторе в Монтериджони.

Позже Эцио узнает, что его семью предала семья Пацци. Он решает расквитаться с предателями. Сперва он убивает младшего из этой семьи, Вьери Пацци, затем его отца, Франческо Пацци, а затем старшего из семьи предателей — Якопо Пацци. Из собрания тамплиеров, в котором непосредственно участвовал Якопо, Эцио узнал, что его приключение заводит его в Венецию, где он и гильдия воров убивают одного из заговорщиков — Эмилио Барбариго, который отравил венецианского дожа. Затем, Эцио убивает других прихвостней главного своего врага — некоего испанца. После нахождения частицы Эдема — яблока Эдема, Эцио отправляется в Романью, где помогает Никколо Макиавелли и Катерине Сфорца защитить их город — Форли. Но таинственное яблоко было украдено, и поиски его приводят нашего героя обратно во Флоренцию. Эцио убивает 9 политических деятелей и заговорщиков по всему городу и в конце концов отбирает яблоко у вора — Джироламо Савонаролло. Главный враг Эцио, Родриго Борджиа, становится Папой римским, и Эцио отправляется на решающий бой в Рим, где побеждает главного врага игры и узнает великие тайны. Это и то, что Эцио таинственный пророк, и то, что скоро грядет конец света.